Методи визначення кислотності та активності ферментів.
1. Електрометричні методі визначення кислотності в темне забарвлених та каламутних розчинах.
Визначення летких кислот. Визначення активної кислотності, колориметричний метод. Визначення активності ферментів.
Методичні рекомендації що до вивчення питання №1
Зверніть увагу на сутність електрометричного визначення кислотності, який застосовують поруч з індикаторним методом. Точка нейтралізації визначається як моменти рівноваги потенціалів,
Рекомендована література: А. Т.Марх, Т.Ф. Зыкина, В. Н.Голубев. Технохимический контроль консервного производства. М.: – ВО Агропромиздат, 1989. с.102-109
1. Визначення електрометрії кислотності в темнозабарвлених І каламутних розчинах
Визначення кислотності в темнозабарвлених і каламутних розчинах звичайним способом (за допомогою кольорових індикаторів або пробій на лакмусовий папірець) в більшості випадків значно утруднено і дає неточні результати.
У таких випадках користуються способом титрування електрометрії. Для такого титрування служить особливий прилад, в якому складається ланцюг: насичений розчин хлористого калію (практично нейтральний розчин) і випробовувана рідина. У обидва розчини додається хінгидрон. Між двома хінгидронними електродами, унаслідок різної дисоціації хінгидрона в нейтральному (КС1) і кислому середовищі, виникає різниця потенціалів, які вирівнюються у міру надбавки лугу до досліджуваного розчину.
Точка нейтралізації визначається як момент рівності потенціалів, що виникають на межі електродів, між стандартним і аналізованим розчином.
Визначення електрометрії ведеться приладом, запропонованим Українським науково-дослідним інститутом харчової промисловості.
Прилад складається з посудини, в яку налитий досліджуваний розчин. Туди ж занурений платиновий електрод з ртутним контактом. Через пробку судини проходить трубка, сполучена з бюреткою для лугу. Крім того, в пробці закріплена судина для стандартного розчину. Судина ця має вид циліндрової трубки з пробкою, пришліфованою в нижній її частині. У судину опускається другий платиновий електрод. Від обох електродів йдуть дроти до ключа-переривника і від нього до нульового гальванометра. Гальванометр в своїй нижній частині має дві головки. Перша головка служить для аретирування приладу, друга — для встановлення стрілки приладу на нульовому розподілі шкали. Гальванометр сполучений так, що струм через нього проходить тільки при натиску на головку ключа.
Техніка роботи з приладом наступна. У судину для стандартного розчину до половини наливають насичений розчин КС1, додають небагато хінгидрона і опускають в нього платиновий електрод. Потім кілька разів повертають пришліфовану пробку з таким розрахунком, щоб розчин КС1 добре змочив шліф. Це на 5—6 годин забезпечить дію стандартного електроду. У іншу судину наливають відміряну кількість досліджуваного розчину і невелику кількість хінгидрона. Якщо підлита кількість аналізованого розчину не покриває електрод і шліф, в судину додають дистильовану воду. Пробка з укріпленими в ній електродами ставиться на місце і вільні кінці дротів від ключа і гальванометра опускаються в трубки так, щоб вони на 1 см занурювалися в ртуть.
Вміст склянки перемішується збовтуванням. Поворотом головки в гальванометрі стрілці додається вільне коливання. На початку коливання стрілки будуть максимальними, але у міру подальшого додавання титрованого розчину до аналізованого розчину значення зменшуються і до моменту нейтралізації при натиску ключа стрілка залишиться на 0. При незначному надлишку лугу стрілка різко відхилиться в протилежну сторону. Під час титрування перед натиском ключа вміст посудини кожного разу треба збовтувати.
Кислотність розраховується, як при звичному індикаторному титруванні, тобто по кількості витраченого титрованого розчину лугу.
Методичні рекомендації що до вівчення пітання №2.
Зверніть увагу на те, які кислоті відносять до летких і як їх визначають.
Рекомендована література.
А. Т. Марх, Т. Ф. Зыкина, В. Н. Голубев. Технохимический контроль консервного производства. М.: – ВО Агропромиздат, 1989. с.110-122.
2. Визначення летких кислот
До летких кислот відносять такі органічні кислоти, як мурашина, оцтова і ін., що володіють здатністю переганятися з водяними парами. На цій властивості летких кислот і засновано їх кількісне визначення.
Для визначення летких кислот на технічних вагах відважують наважку продукту пюре або мезги в 25 г і поміщають її в колбу місткістю 500 мл (мал. 20). Сюди ж підливають біля 150мл води і 1мл 10%-ний фосфорної кислоти. При аналізі плодових соків і вин в колбу переносять піпеткою 50 мл вина або соку. Колба через краплеуловлювач з’єднується з холодильником і може бути сполучена з пароутворювачем гумовою трубкою. Відігнавши близько половини об’єму рідини, з пароутворювача пускають пару і продовжують перегонку до тих пір, поки не набереться біля 
Мал. Визначення летких кислот.
200 мл відгону. Потім в відгоночну рідину додають 5 крапель фенолфталеїну і титрують децінормальним лугом до появи рожевого забарвлення.
Кількість летких кислот у відсотках, в перерахунку на оцтову кислоту, визначають по формулі:
Де: А — наважка продукту, г
П — кількість децінормального лугу з введеною поправкою на даний розчин (у мілілітрах),
0,006 — титр децінормального лугу по оцтовій кислоті.
Методичні рекомендації що до вівчення пітання №3.
При вивченні даного. питання зверніть увагу на відмінність активної кислотності від загальної, методику визначення активної кислотності із застосуванням електрометричного та індикаторного колориметричного методу.
Рекомендована література.
А. Т. Марх, Т. Ф. Зыкина, В. Н. Голубев. Технохимический контроль консервного производства. М.: – ВО Агропромиздат, 1989. с.110-122.
3. Визначення активної кислотності, колориметричний метод.
Активна, або істинна, кислотність — це концентрація водневих іонів, виражена в грам-іонах водню на літр розчину. Концентрація водневих іонів (Н) залежить від ступеня дисоціації кислоти. Якщо порівнювати між софою кислоти однакової нормальності, то в одному і тому ж об’ємі вони містять одне і те ж число грам-атомів водню. Число ж іонів водню в кожному літрі кислоти буде різне, залежно від ступеня її дисоціації. Так, у децінормального розчину кислот при 18°, що містить в 1 л 0,1 г атоми водню, ступінь дисоціації і число грам-іонів водню буде наступним:
|
Назва кислоти |
Ступінь дисоціації (у %) |
Вміст грам-іонів водню в 1л. |
|
Сірчана |
60 |
0,0600 |
|
Соляна |
90 |
0,0900 |
|
Щавлева |
31 |
0,0310 |
|
Оцтова |
1,2 |
0,0012 |
Отже, загальна кислотність (визначувана титруванням) і активна (що виражається концентрацією водневих іонів) є абсолютно різними величинами.
Визначення активної кислотності при дослідженні плодоовочевих продуктів дуже важливе. Всі ферментативні процеси, процеси розкладання при зберіганні плодоовочевих продуктів, консервація їх за допомогою тих або інших антисептиків, нарешті, кислий смак продукту — все це залежить від концентрації водневих іонів.
Концентрація водневих іонів виражається дуже малими величинами, що незручне для обчислення і графічного зображення. Тому замість числа, що виражає концентрацію водневих іонів, користуються десятковим логарифмом цього числа, узятим із зворотним знаком, і позначають цей «водневий показник» символом рН:
Водневі іони в незначній кількості містяться і в чистій воді, оскільки вода теж частково випробовує електролітичну дисоціацію на Н і ОН, причому (Н)×(ОН’)=К, тобто множення концентрації обох іонів Н і ОН’ постійно для певної температури. Для температури в 18° К – 10-14’14 З причини рівності концентрацій Н і ОН’ в чистій нейтральній воді, 
тобто концентрація водневих іонів однакова з концентрацією гідроксильних іонів і кожна з них при 18° дорівнює 10-7,07 або 
. Отже, нейтральна реакція характеризується наступним станом при 18°: (Н’) = (ОН’) = 10-7’07 або рН = 7,07. Приймаючи для нейтрального середовища рН = 7, одержимо достатню точність.
У кислих розчинах кількість водневих іонів збільшується, тому рН для них повинно бути менше 7 і стає тим менше, чим кисліше середовище. У лужних розчинах кількість гідроксильних іонів збільшується, тому іонів (Н) стає менше і величина рН для них, отже, буде більше 7.
Для визначення активної кислотності існують два методи: електрометричний і індикаторний колориметричний.
Спосіб електрометрії визначення рН заснований на залежності між зміряною величиною електричної напруги і кількістю іонів в розчині. Метод цей дає точні результати, але вимагає складної апаратури і значної витрати часу.
Колориметричний метод менш точний, але не вимагає складної апаратури і надзвичайно простий, тому їм найчастіше і користуються в лабораторній практиці для визначення рН.
Підставою для колориметричного методу визначення рН є здатність деяких індикаторів міняти своє забарвлення не відразу, а поступово, у зв’язку із зміною кислотності розчинів. Отже, якщо до двох різних розчинів з однаковою концентрацією водневих іонів додати відповідний індикатор, обидва розчини забарвляться в однаковий тон. І, навпаки, якщо два розчини з однаковими індикаторами мають один і той же тон перехідного забарвлення, це указує на однакову концентрацію в них водневих іонів.
Окрім індикаторів, для колориметричного визначення рН необхідно мати ряд стандартних розчинів з різними, але певними кількостями рН. Ці стандартні розчини одержують звичайно змішуванням двох так званих буферних розчинів (наприклад, 0,1 N розчин біфталата калія з 0,1 N Розчином соляної кислоти або з 0,1 N розчином їдкого натрію). Змішуючи буферні розчини в різних пропорціях, одержують стандартні розчини з різною, але визначеною величиною рН. Ці розчини після додавання до них індикатора і служать для порівняння з аналізованим розчином, до якого також додають індикатор, що приймає чи те інше забарвлення, залежно від кількості рН.
Для визначення рН колориметричним способом користуються особливим приладом. Він складається з набору запаяних скляних пробірок з буферними розчинами, які утворюють шкалу необхідних концентрацій рН з градацією 0,2, і особливого штатива для пробірок (компаратора) з шістьма отворами, розташованими по 3 в 2 ряди.
Якщо досліджувана рідина прозора, користуються одним рядом отворів. У один з середніх отворів ставлять пробірку, наливають в неї 5 см3 аналізованого розчину і декілька крапель того ж індикатора, який знаходиться в стандартних розчинах. У сусідні отвори вставляють пробірки із стандартними розчинами і через бічні отвори компаратора спостерігають відтінок розчинів. Визначення вважають закінченим тоді, коли підбором стандартних розчинів знайдений відповідний тон забарвлення.
КОмпаратор
Якщо досліджувана рідина забарвлена або каламутна, користуються шістьма отворами в компараторі. Встановивши в одному ряду пробірки, як було показано вище, в другий ряд проти досліджуваного забарвленого розчину з індикатором ставлять пробірку з дистильованою водою. З боків її, проти пробірок із стандартними розчинами, поміщають пробірки з досліджуваним розчином, але без індикатора. Спостерігаючи забарвлення через бічні отвори компаратора, ми при такому розташуванні пробірок усуваємо власне забарвлення аналізованого розчину і спостерігаємо лише ту зміну забарвлення, яка залежить від індикатора і кількості рН.
При визначенні рН в сильно забарвлених розчинах (у ягідних соках, винах) розчин можна в 4—6 разів розбавити водою. При розбавленні, наприклад удвічі, концентрація кислоти в одиниці об’єму буде удвічі менше, та зате і дисоціація з розбавленням збільшиться удвічі і, отже, рН не змінить своєї величини.
Методичні рекомендації що до вивчення питання №4
При вивченні питання з’ясуйте, яку роль виконують ферменти при виробництві продуктів та як впливають на властивості сировини. Ознайомтесь з визначенням ферментної активності способи її вираження і методами визначення.
Рекомендована література: А. Т.Марх, Т.Ф. Зыкина, В. Н.Голубев. Технохимический контроль консервного производства. М.: – ВО Агропромиздат, 1989. с.172-190.
4. Визначення активності ферментів
Ферменти (ензіми) – біокаталізатори які являються прискорювачами біохімічних реакцій, що відбуваються в клітинах продуктів (сировини). В процесі виготовлення багатьох продуктів харчування ферменти відіграють дуже важливу роль бо являються рушійною силою при проведенні технологічних процесів і впливають на формування споживчих властивостей і якості продуктів. В багатьох випадках ферменти призводять до руйнівних процесах, небажаних процесів а також псуванні продуктів. Для ферментів характерна вибірковість дії, тобто кожний фермент діє на певний вид речовин і каталізує відповідно якийсь один процес.
Розглянемо активність гідролітичних ферментів. Ферментативна активність препарату і сировини виражається в довільно обраних одиницях, обумовлених кількістю перетвореного субстрату (продукту, на котрий діє фермент) за одиницю часу при оптимальних умовах для дії ферменту (часу, температури й активної кислотності), стандартизованих для кожного ферменту. У ряді випадків ферментативну активність визначають за швидкістю утворення продукту реакції. Для точного визначення ферментативної активності в усіх методиках повинні бути враховані тривалість ферментативної реакції, концентрація субстрату і способи його приготування, а також приготування ферментного розчину.
Розглянемо прийняті в науці способи вираження активності гідролітичних ферментів.
Пектолітична активність (Пкс)—характеризує здатність ферментів каталізувати розщеплення пектину.
Одна одиниця ПкС — кількість ферменту, що здатний каталізувати розщеплення 1 мг пектину за 1 ч при температурі 37—38 °С.
Методика визначення пектолітичної активності заснована на гідролізі пектину досліджуваним розчином ферментного матеріалу. Як субстрат береться 1%-ный розчин промислового пектину — яблучного або бурячного.
Протеолітична активність (ПС) —характеризує здатність ферментів каталізувати реакцію гідролізу білка до пептидів і амінокислот (на 1 г або 1 см3 ферментного матеріалу).
За одиницю ПС приймається така кількість ферменту, що утворить 1 мг амінного азоту за 1 год. при температурі 40 °С и рН 7,0—7,3.
Суть методу зводиться до визначення вільних карбоксильних груп у спиртових розчинах амінокислот і поліпептидів, що утворяться при гідролізі білка. Найчастіше як субстрат використовують 5%-ный розчин желатину.
Протеолитическая активність розраховується по формулі
ПС=(V0-Vк)VeCM/(tVф)
Де Vo, VК — кількість розчину NaOH, що пішло на титрування 1 см3 відповідно дослідної і контрольної проб, см3; V — загальний обсяг реакційної суміші, см3; е — фактор розведення, для витяжки з рослинних об’єктів е=10, для розчинів ферментних препаратів е=1000; С — молярна концентрація NaOH (0,1 моль/дм3); М — молекулярна еквівалентна маса азоту (14 г/моль); t — час протеолізу, год.; Vф — кількість ферментного розчину в реакційній суміші, см3.
Інвертазная активність (ІС) — характеризує здатність ферменту каталізувати розщеплення цукрози.
Продукти, що містять інвертазу (цукразу, β-фруктозидазу), характеризуються кількістю одиниць ІС, що утримуються в 1 г або 1 см3 ферментного матеріалу.
Одній одиниці ІС відповідає така кількість інвертази, що викликає 50%-ное розщеплення цукрози за 1 хв., причому масова частка цукрози повинна складати 2,375 м у 50 см3 розчину. рН розчину повинний відповідати 4,62, температура при інверсії 30 °С.
У результаті дії інвертази утвориться інвертний цукор (суміш рівних кількостей глюкози і фруктози).
Амілолітична активність (АС) — характеризує здатність ферментів каталізувати розщеплення крохмалю.
Одна одиниця АС відповідає такій кількості ферменту, що здатний каталізувати гідроліз 1 г розчинного крохмалю до продуктів, що не дає забарвлення з йодом, за 1 год. при температурі 30 °С. Субстратом є розчинний крохмаль.
Величина амілолітичної активності розраховується за формулою:
АС= 0,25×60/(mt)
Де 0,25 — кількість крохмалю, що знаходиться в 25 см3 його 1%-ного розчину, г; m — маса навішення ферментного препарату, узятого на аналіз, г; t — час, за який відбулося розщеплення крохмалю до продуктів, що не дає забарвлення з йодом, хв.
Оцукрююча активність (ОС) — здатність амілолітичних ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до мальтози.
За одиницю ОС прийнята така кількість ферменту, що за 1 год. при температурі 30 °С и рН 4,7 каталізує розщеплення 1 г розчинного крохмалю до мальтози.
Для визначення ОС проводять гідроліз 0,25 м розчинного крохмалю 37 см3 досліджуваної ферментної витяжки протягом 10 хв. Подальша дія ферменту припиняють додаванням НС1. Після цього визначають кількість утвореної мальтози йодометричним методом.
Сичужна активність (СС) – характеризує здатність ферментів каталізувати реакцію згортання молока її визначають за часом, що протикає з моменту внесення ферментного препарата в молоко до появи сирного згустку при температурі 40°С
Крім того визначають декстринуючу активність (ДС), мальтозну активність (МС), глюкооксидазну активність (ГС), цітолітичну активність (ЦС), які визначаються в різних продуктах з метою визначення якості сировини та технології виробництва продуктів.
Ви прочитали: "Методи визначення кислотності та активності ферментів"Читати далі