2.
Якісна оцінка мікрофлори молока та молочних продуктів
Мета заняття. Ознайомитися з методами якісної оцінки молока та молочних продуктів.
Завдання: 1. Приготувати та провести мікроскопію мазків молока, заквасок та молочних продуктів. 2. Визначити в мазках основні форми бактерій (коки, палички та звивисті форми). Звернути в мазках на наявність дріжджів та пліснявих грибів 3. Замалювати побачене.
Обладнання та матеріали: Світловий
Довідковий матеріал.
Якісна оцінка мікрофлори молока, заквасок чи молочних продуктів передбачає встановлення видового складу мікроорганізмів. Встановлення виду мікроорганізмів проводять перш за все шляхом мікроскопії мазків із молока, заквасок чи молочних продуктів.
Перед тим як розпочати виготовлення препаратів для мікроскопії необхідно Підготувати предметні скельця. Вони повинні бути сухими та знежиреними. Доказом знежирення є рівномірний розподіл краплі води на поверхні скла.
Нові скельця спочатку миють у мильному розчині, зполіскують в теплій воді, знежирюють у розчині спирт-ефіру. Використані скельця спочатку витримують в розчині сірчаної кислоти, а потім кип’ятять в розчині соди та мильної води, після чого ополіскують у воді та висушують в сушильній шафі.
Оброблені таким чином скельця зберігають в скляній банці сухими чи в розчині спирт-ефіру. Скельця беруть пінцетом, так як пальці залишають жирні плями. Якщо скельця зберігаються в розчині спирт-ефіру, то їх протирають фільтрувальним папером чи бавовняною тканиною.
1. Виготовлення препарату для мікроскопії. Препарат готують за допомогою бактеріологічної петлі (з платини) чи пастерівських піпеток.
2. Висушування препарата-мазка поводять на повітрі або в термостаті. Підігрівати препарат не потрібно, так як при швидкій втраті вологи відбувається груба коагуляція (згортання) білків і клітина втрачає свою природню форму.
3. Фіксацію висушеного препарату здійснюють фізичним або хімічним способом.
Фізичний спосіб. Для цього треба тричі провести скельце з мазком над поверхнею полум’я спиртівки (протягом 6 с).
Хімічний спосіб. Для цього мазок обробляють розчинами: метилового (5 хв) або етилового спирту (10 хв) чи сумішшю спирту та ефіру.
Зафіксований мазок називається мікробіологічним препаратом для мікроскопії.
4. Фарбування препарату проводять простими чи складними методами.
Прості методи фарбування – застосовують один барвник (наприклад, фуксин Пфейффера або метиленовий синій). Наносять на фіксований препарат фуксин Пфейффера (на 2 хв) або метиленовий синій (на 3 — 5 хв); промивають водою; висушують фільтрувальним папером.
Складні методи фарбуваннядозволяють відрізнити мікроорганізми один від одного або виявити особливості їх структури (наявність спор та капсул). До них відносять фарбування за Грамом (виявляють грампозитивні або грамнегативні мікроорганізми), за Романовським – Гімзою (виявляють спірохети) та методи фарбування для виявлення спор та капсул (Техніка методу фарбування за Грамом див. додаток А).
Суть методу фарбування за Грамом. Здатність чи нездатність мікроорганізмів фарбуватись по Граму залежить від хімічного складу бактеріальної стінки. У Грамнегативних мікроорганізмів (фарбуються у червоний колір) проста будова бактеріальної стінки (невелика кількість полісахаридів (пептидоглікан) до 10% або один шар) яка легко вимивається спиртом та знебарвлюється. У Грампозитивних (фарбуються у фіолетовий або синій колір) – складна бактеріальна стінка (до 80% полісахариду, кілька шарів) і при обробці спиртом вона не вимивається та зберігає інтенсивність забарвлення. Техніка методу фарбування за Грамом наведена в Додатку А.
Після фарбування мазку проводять його мікроскопію, при цьому в першу чергу звертають увагу на зовнішній вигляд мікроорганізмів, які спостерігаються в полі зору (форму бактерій, наявність дріжджів та пліснявих грибів).
Форми бактерій. По формі бактерії прийнято поділяти на кулясті (коки), паличкоподібні та звивисті
Кулясті форми бактерій (кокоформи). По розміщенню клітин відносно один одного та характеру поділу при розмноженні кокоформи поділяють на:
мікрококи – поодиноко розміщені, ізольовано один від одного клітини округлої форми, діляться в рівних площинах;
Диплококи – клітини розміщені попарно, внаслідок поділу в одній площині та збереження зв’язку між двома дочірніми клітинами;
Стрептококи – клітини розміщені у вигляді ланцюжків різної довжини, внаслідок поділу в одній площині та збереження зв’язку між дочірніми клітинами;
Стафілококи – хаотично розміщені клітини у вигляді грона винограду.
Тетракоки – кулясті клітини розміщені по чотири, внаслідок поділу у двох взаємно перпендикулярних площинах.
Сарцини – клітини розміщені у пакетах кубоподібної форми по 8 – 16 клітин, внаслідок їх поділу у трьох взаємно перпендикулярних площинах.
Паличкоподібні бактерії (палички) мають осьову симетрію та циліндричну форму із заокругленими чи гострими краями. Їх поділяють на палички, які не мають спор або бактерії та палички, які мають спори – це бацили та клостридії.
Бацили – це паличкоподібні мікроорганізми, які мають спори з діаметром, який не перевищує ширини мікробної клітини.
Клостридії – це паличкоподібні мікроорганізми, які мають спори з діаметром, що перевищує ширину мікробної клітини.
Крім того, в залежності від взаємного розташування клітин паличкоподібні бактерії поділяють на поодинокі та безсистемні скупчення, диплобактерії та диплобацли (попарно розміщені бактерії та бацили), стрептобактерії та стрептобацили (розміщення бактерій та бацил у вигляді довгих та коротких ланцюжків).
Звивисті форми мікроорганізмів поділяють на:
вібріони – мають форму коми або неповного завитка;
Спірили – мають від одного до п’яти завитків;
Спірохети – мають велику кількість мілких завитків.
Кокоформи в більшості випадків фарбуються Грам+, звивсті форми – Грам-. Серед палчковидних форм зустрічаються як Грам+ так і Грам – мікроорганізми
Морфологія дріжджів. Дріжджі (дріжджові гриби, аскоміцети)– це одноклітинні, нерухливі мікроорганізми, що мають різну форму (округлу овальну, еліпсовидну, рідше циліндричну та лимоновидну). Будова клітин дріжджів більш складна за будову бактеріальних клітин (мають подвійну оболонку, диференційоване ядро, в цитоплазмі включення (краплі жиру, включення глікогену, вакуолі)). Розмір дріжджових клітин більший ніж бактеріальних.
Більшість дріжджів є факультативним анаеробами, добре ростуть в кислому середовищі (ацидофіли). По відношенню до температури є мезофілами (оптимальна температура для їх розвитку 25-30°С). В природі дріжджі знаходяться на поверхні плодів і ягід, в грунті, воді та в шлунково-кишковому тракті людей та тварин. Є патогенні та умовно-патогенні види, які викликають кандидамікози.
Більшість дріжджів є збудниками спиртового бродіння (анаеробне окислення вуглеводів до етилового спирту )
С6Н12О6 ® 2СН3СН2ОН + 2СО2 + Е
глюкоза етиловий спирт
Класифікують дріжджі за способом розмноження: брунькуванням (несправжні або несахароміцети ) чи спороутворенням (справжні дріжджі або сахароміцети) (рис. 7). В молоці та молочних продуктах найчастіше зустрічаються спророутворюючі дріжджі родини Saccharomycetaceae (родів Saccharomyces, Zygosaccharomyces) та дріжджі, що розмножуються брунькуванням з родини Torulopsidaceae (родів Torulopsis, Candida, Mycoderma и др.).
Дріжджі, які мають властивість до утворення спор (родина Saccharomycetaceae, до якої відносять роди Saccharomyces, Zygosaccharomyces) є активними в процесі спиртового бродіння, тому їх використовують в промисловостях, як пекарські, пивні, а в молочній промисловості вводять до складу заквасок для ацидофільно-дріжджового молока, кефіру та кумису. Крім того спороутворюючі дріжджі використовуються при виготовлені сирів з сирною слиззю (наносять на поверхню сиру разом із спорами пліснявих грибів).
Дріжджі, які розмножуються брунькуванням називаються несправжніми (родина Torulopsidaceae, до якої відносять роди Torulopsis, Candida, Mycoderma та ін..), вони широко поширені в природі і викликають вади в молочних продуктах (в сирах викликають спучування, «бомбаж» молочних консервів, крім того надають молочним продуктам (кисломолочний сир, сметана) невластивого спиртового смаку, запаху та сприяють значному газоутвореню).
Морфологія пліснявих грибів. Плісняві гриби (нитчасті гриби) – це безхлорофільні мікроорганізми, які живуть на поверхні субстратів.
Основою вегетативного тіла пліснявих грибів є гіфи, сплетіння яких утворюють міцелій. Є два види міцелію – нижній або субстратний, що вростає в субстрат та верхній або повітряний, на якому розміщені спорангієносці. Під мікроскопом гіфи видно у вигляді трубчастих волокон, які складаються із тонкої клітинної стінки, одного чи кількох ядер та цитоплазми.
Плісняві гриби – аероби, яле можуть рости і в глибині продукту при мінімальному доступі кисню. Мезофіли, але можуть розвиватися і при низьких температурах – від +5 до -2°С. Ацидофіли, так як полюбляють кисле середовище. Спори грибів гинуть при пастеризації молока, проте стійкі до дизенфікуючих речовин.
В залежності від будови міцелію плісняві гриби є одноклітинними та багатоклітинними. У більшості грибів гіфи поділені перегородками на окремі клітини (багатоклітинні), отже міцелій у них септований (аспергили, пеніцили). Інші гриби не мають перегородок у гіфів, тому мають вигляд однієї великої клітини з багатьма ядрами (одноклітинні).
До одноклітинних пліснявих грибів відносять гриб роду Мисоr, Rhizopus, Thamnidium (рис. 8).
Плісняві гриби роду Мисоr (Мукор) – міцелій представлений однією розгалуженою клітиною, від якої відходить спорангієносць з спорангієм та спорами. Пліснява має вид ніжного сірувато – білого дуже густого пушка, росте на різних продуктах та грунті.
Плісняві гриби роду Rhizopus (Різопус) характеризуються тим, що до субстрату кріпляться коренеподібними виростами (ризоїдами),які утворюють вузлики від яких відходять спорангієносці із спорангіями.
Плісняві гриби роду Thamnidium (Тамнідіум) на відміну від плісняви роду Мuсог мають в середній частині спорангієносця так звані спорангіоли, які нагадують гантелі, в середині яких дозрівають спори. Представники цих родів можуть розвиватися в холодильниках при -9 до -11 градусів.
До багатоклітинних пліснявих грибів відносять плісняві гриби роду Penicillium та Aspergillus, Catenularia, Cladosporium, Oidium lactis. Плісняві гриби саме цих родів найчастіше зустрічаються в молчних продуктів.
Пліснява роду Aspergillus на відміну від інших багатоклітинних видів плісняви має несептований дуже довгий конідієносець, який в верхній частині закінчується булавовидним потовщенням. Від нього радіально в різні боки відходять клітинні вирости стеригми з конідіями, які розміщуються ланцюгами. Під мікроскопом конідієносиць з стергмами та конідіями нагадує вид садової лійки в той момент, коли з неї виливається вода (лійкова пліснява). Росте на різних продуктах в центрі чорного кольору, а по бокам білого.
Пліснява роду Penicillium має багатоклітинний міцелій та конідієносец у вигляді мутовки чи кисті руки, на верхушці, якого знаходяться ланцюжки конідій. В зв’язку з цим плісняву називають кистеподібною. Вона росте на різних субстратах у вигляді зеленого по середні та білого по боках пухнастого нальоту. Представників цього роду використовують при виробництві м’яких пліснявих сирів. Конідії цих грибів розпилюють на поверхню сиру.
Пліснява роду Cladosporium (гроноподібна пліснява) має слаборозвинутий міцелій, на повітряних гіфах якого формуються великі оливково-зелені овальні або округлі конідії, які групуються в грона. Ця пліснява викликає темні плями на маслі та його прогіркання.
Пліснява роду Catenularia (шоколадно коричнева пліснява) – має короткий розгалужений конідієносець від якого відходять довгі ланцюжки конідій, що нагадують намисто. Ця пліснява розвивається на солодких молочних консервах у вигляді коричневих кононій (тим самим викликає вади консервів).
Молочна пліснява Oidium lactis не має спеціальних гіф для розмноження. Недорозвинуті конідії утворюються внаслідок розпаду кінцевих ділянок повітряного міцелію та являють собою прямокутні чи овальні клітини, які формують білий пігмент. В міцелії пігмент не утворюється, тому незріла пліснява має вигляд сіруватого нальоту. Пліснява зустрічається на молочних та інших продуктах у вигляді білого ніжного пушку.
Плісняві гриби мало використовуються у вітчизняній молочній промисловості (лише для виготовленні сирів з пліснявою – сир рокфор). За кордоном сир з пліснявою широко представлений в асортименті сирів. Плісняві гриби викликають глибокий розпад білків, жирів та інших складових молока, чим спричиняють появу вад молочних продуктів (пліснявіння сухого молока при підвищеній вологості, пліснявіння масла та кисломолочних продуктах (сметана, сир та кисломолочний сир) при довготривалому зберіганні. Деякі гриби в процесі росту на молочних продуктах можуть утворювати отруйні речовини: мікро – та афлотоксини, тому можуть бути збудниками харчових мікотоксикозів.
Виготовлення препаратів для мікроскопії грибів та дріжджів. За допомогою бактеріальної петлі знімають поверхневий (повітряний) міцелій гриба з субстрату та обережно вносять його у краплю води (або фізрозчину), яка заздалегідь була нанесена на предметне скельце. Краплю води з міцелієм гриба накривають покривним скельцем та злегка придавлюють, щоб видалити пухирці повітря. При цьому визначають одноклітинну чи багатоклітинну будову міцелію, звертають на форму спорангіїв та спорангієносців. Крім того, в препараті завжди спостерігають велику кількість вільно розміщених спор, що висипалися із спорангіїв, які лопнули.
Для мікроскопічного дослідження дріжджів на предметне скло наносять краплю дріжджів у фізрозчині та накривають покривним скельцем (роздавлена крапля). Розглядають під мікроскопом в затемненому полі зору, для чого звужують діафрагму конденсора. Звертають на форму та розмір дріжджових клітин та на наявність форм, що розмножуються брунькуванням.
Послідовність виконання роботи
Завдання 1. Приготувати предметні скельця для мікроскопії.
Завдання 2. Виготовити препарат для мікроскопії з молока, заквасок чи молочнокислих продуктів.
Завдання 3. Пофарбувати приготовлені препарати для мікроскопії простим методом (метиленовою синькою) та методом по Граму та провести їх мікроскопію. При цьому звернути увагу на наявність в мазках основних форм мікроорганізмів, дріжджів та пліснявих грибів
Завдання 4. Замалювати побачене в робочих зошитах (форми бактерій, дріжджів та пліснявих грибів).
Завдання 5. Заповнити нижченаведену таблицю 3.
Таблиця 3
Особливості морфологічної будови і розмноження
Дріжджів та пліснявих грибів.
|
Дріжджі |
Плісняві гриби |
|
|
Особливості морфологічної будови |
||
|
Особливості розмноження |
||
|
Значення для молочної промисловості |
Питання для самоконтролю.
Як готують предметні скельця для виготовлення препарату для мікроскопії? Які методи використовують для фарбування препаратів для мікроскопії? В чому суть методу фарбування по Граму? Перерахуйте основні форми бактерій. Дайте коротку характеристику кожній із форм бактерій? Що таке дріжджі і як вони класифікуються? Які особливості будови дріжджів? Яке значення мають дріжджі для молочної промисловості? Яка класифікація пліснявих грибів? Які особливості морфології пліснявих грибів? Як використовують плісняві гриби в молочній промисловості?
Ви прочитали: "Якісна оцінка мікрофлори молока та молочних продуктів"Читати далі