Поняття іммобілізації ферментів та способи її проведення.
Ферменти являють собою високо спеціалізовані каталізатори білкової природи, що прискорюють хімічні реакції в тваринних та рослинних організмах. Вони є рушійною силою біохімічних процесів в живих організмах. Всі ферментативні реакції проходять легко та швидко. Ферментативні реакції, що каталізуються в організмах не супроводжуються утворюванням побічної продукції.
Ферменти прискорюють реакції в десятки тисяч і мільйони разів. Дія ферментів строго специфічно,
Ферменти діють при визначеній температурі, рн середовища; їхня активність залежить від наявності хімічних речовин — активаторів і інгібіторів. Найважливішим фактором, від якого залежить дія ферментів, є температура. Активність ферменту (швидкість каталізуємої їм реакції) зростає з підвищенням температури. Оптимальна температура, тобто температура, при якій спостерігається максимум активності ферментів, для більшості з них 40—50 "С. При подальшому підвищенні температури активність ферменту знижується. При температурі 60—80 °С білок, що утворить фермент, денатурує і фермент інактивується (утрачає свою активність). При денатурації білка, як відомо, відбувається розгортання поліпептидного ланцюга з утратою їм біологічних властивостей.
Теплова денатурація ферментів має важливе практичне значення: пастеризація сировини сприяє руйнуванню ферментів і охороняє харчові продукти від ферментативного псування.
Доведено, що деякі ферменти мають здатність відновлювати свою активність після теплової денатурації. Відбувається мимовільне повторне згортання поліпептидного ланцюга білка з відновленням нативної (первісної) форми, що володіє ферментативною активністю. Це явище Називається Реактивацією ферменту.
Важливим фактором, що впливає на активність ферментів, є рн середовища. Ферменти розрізняються по оптимальним для їхньої дії рн. Так, оптимум дії пепсину знаходиться при рн 1,5—2, сичугового ферменту — при рн 6,2, лужної фосфатази — при рн 9,5. Як правило, при занадто кислій або лужній реакції середовища відбувається денатурація ферменту і він утрачає свою активність.
По хімічній природі ферменти являють собою білкові речовини. Вони можуть бути простими і складними білками. Небілкова частина складних білків називається Коферментом. До-ферментами можуть бути метали, вітаміни й інші з’єднання. Більшість гідролітичних ферментів є простими білками, окислювально-відновні і деякі інші ферменти — складними. Ферменти називають по тій речовині, на яке вони діють, додаючи до кореня назви закінчення «аза»: ліпаза, лактаза пептидаза й ін. Крім цих робочих назв маються більш складні систематичні назви, що відбивають механізм дії ферменту. В даний час відомо більш 1000 різних ферментів. Ферменти підрозділяють на шість класів: оксидоредуктази (ферменти, катализуючи окислювально-відновні реакції); трансферазы (ферменти, що переносять групи); гідролази (гідролітичні ферменти); ліази (ферменти відщіплення груп); ізомерази (ферменти ізомеризації); синтетази.
З усіх перерахованих класів ферментів найбільше практичне значення мають оксидоредуктази і гідролази.
З молока, отриманого при нормальних умовах від здорової тварини, виділено більш 20 щирих, або нативних, ферментів. Велика їхня частина (лужна фосфатаза, ксантин-оксидаза, пероксидаза та ін.) утвориться в клітках молочної залози і переходить у молоко під час секреції. Менша частина, імовірно, переходить у молоко з крові тварини (протеаза, каталіза й ін.).
Численні ферменти утворяться мікроорганізмами молока. Вони можуть бути позаклітинними і внутрішньоклітинними. Позаклітинні ферменти (екзоферменти) в основному зв’язані з процесом харчування і тому легко виділяються клітками в навколишнє середовище. Внутрішньоклітинні (ендоферменти) діють усередині клітки і виділяються тільки після її відмирання й автолізу (розпаду).
Склад нативних і мікробних ферментів молока. У молоці ферменти знаходяться у вільному стані, а також зв’язані з казеїновими міцелами й оболонками жирових кульок.
Знання властивостей ферментів, що зустрічаються в молоці і молочних продуктах, необхідно фахівцеві молочної промисловості з кількох причин. По-перше, на дії ферментів засноване виробництво кисломолочних продуктів і сиру. По-друге, ферменти можуть викликати небажані зміни складових частин молока і молочних продуктів з наступним виникненням пороків. По-третє, деякі властивості ферментів можна використовувати для санітарно-гігієнічної оцінки сирого молока і контролю ефективності його пастеризації.
Поруч з тим, що ферменти відіграють вирішальну роль в живих організмах їм належить значне місце в виробництві харчових продуктів, а також у с/г.
В даний час виділені та вивчені декілька сотень ферментів. Вважають, що жива клітина може мати більше 1000 різних ферментів. Кожен живий організм безперервно синтезує ферменти.
Каталітична активність ферментів в багато разів перевищує активність неорганічних каталізаторів. Ферменти характеризуються специфічністю в дії, що проявляються у тих випадках, коли речовина відрізняється за хімічною структурою. Вони прискорюють як пряму, так і зворотну реакцію, тобто гідроліз та синтез речовини на яку вони діють.
Хімічна природа ферментів. Ферменти поділяють на 2 великих види. Однокомпонентні, що складаються тільки із білка, та двокомпонентні, що складаються з білка та небілкової частини, що називається простетичною групою. Білки ферментів можуть бути простими (протеїнами) та складними (протеїдами). Молекулярна вага ферментів коливається в широких межах – від декількох тисяч до мільйонних, але більшість ферментів мають точну молекулярну вагу. В чистому вигляді всі ферменти є кристалами. Властивості ферментів обумовлені в першу чергу наявністю особливо активних центрів на поверхні білкової молекули та приєднаних до білка особливих хімічних угрупувань.
Кількість ферменту, що є в тканинах в будь-який час виявляється відносними швидкостями його синтезу та розпаду, а також концентраціями різного роду інгібіторів та активаторів. Виявлення активності ферментів проводиться при 30˚С і при оптимальних величинах рН та концентрації субстратах.
Відповідно до класифікації назва ферменту складається з хімічної назви субстрату та назви тієї реакції, що здійснюється ферментом. До латинської назви кореня субстрату додається закінчення аза. Поряд з новими назвами для багатьох ферментів збереглися старі традиційні (пепсин, трипсин).
За сучасною класифікацією всі ферменти поділяють на 6 видів: оксидоредуктази, трансферази, гідролази, ліази, ізомерази, лігази.
Кожен із 6 видів поділяють на підвиди, а кожен підвид на групи.
Оксидоредуктази. Це ферменти, що каталізують окисно – відновні реакції, що відбуваються у живих організмах. Реакції окислення речовин завжди супроводжуються реакціями відновлення. Оксидоредуктази поділяють на чотирнадцять підвидів, що об’єднують приблизно 270 ферментів. Окислення протікає як процес відняття водню від субстрату, а відновлення як приєднання атомів водню до акцептора. Серед оксидоредуктаз основне значення мають дегідрогенази, які здійснюють реакцію дегідрування.
Трансферази. Вони прискорюють перенесення цілих груп та молекулярних залишків з одних з’єднань на інші. Це один із найбільших видів, в складі якого 240 ферментів, що мають велике значення для обміну речовин живих організмів.
Гідролази. Ці ферменти каталізують гідроліз, а інколи і синтез органічних сполук при участі води. Цей вид включає більше 217 ферментів і поділяється на 9 підгруп. Гідролази поділяють на ферменти, що гідролізують глюкозійні зв’язки. Ці ж ферменти гідролізують пептидні зв’язки у білках, а також складні ефіри.
Ліази. Вони об’єднують ферменти, що прискорюють негідролітичні реакції розпаду органічних речовин з відщепленням води, вуглекислого газу та аміаку. В результаті дії ферментів утворюються подвійні зв’язки. Деякі з цих реакцій зворотні і відповідні ферменту при певних умовах каталізують реакції не тільки розпаду, але й синтезу. Вид ліаз включає 117 ферментів.
Ізомерази. Такі ферменти каталізують перетворення органічних сполук у їх ізомери. Ізомерази каталізують перенесення груп тільки в середині молекули. Ці перетворення можуть виявлятися у внутрішньо-молекулярному перенесенню водню, фосфатних та ацетильних груп, в зміні просторового розташування атомних угрупувань, в переміщенні подвійних зв’язків. До виду ізомераз належить сорок сім ферментів.
Лігази або синтетази. Це велика група ферментів, що прискорює синтез складних органічних сполук із більш простих. Реакція синтезу потребує значних витрат енергії, тому активність лігаз проявляється лише в присутності таких сполук, як аденозинтрифосфорна кислота (АТФ) або інший нуклеотидтрифосфадт.
До недавнього часу технологічне застосування ферментів і було економічно недоцільним, тому що індивідуальні або комплексні препарати ферментів мали високу вартість і використовувались одноразово. Після закінчення процесу фермент разом проміжним продуктом або готовою продукцією виводиться з робочої зони і незворотньо втрачається. Тому проблема затримання ферменту в зоні реакції з метою його багаторазового використання була дуже важливою і над її вирішенням і ні вчені різних країн. В середині минулого століття вона була успішно розв’язана.
У живих клітинах ферменти локалізовані, тобто знаходяться в певних структурах клітини — органелах або ендоплазматичному ретикулумі. З’ясувалось, що ферменти утримуються в цих структурах тому, що вони зафіксовані ("пришиті») на їх внутрішніх або зовнішніх поверхнях. Причому в такому зафіксованому стані вони мають більш високу активність, ніж у вільному (делокалізованому). Це явище було використано і в технологічних процесах. Ферменти почали фіксувати (закріплювати) на поверхні водонерозчинних носіїв неорганічного або органічного походження. Такі ферменти отримали назву Іммобілізованих, А процес закріплення — Іммобілізацією ферменту.
Одним з перших способів іммобілізації було Закріплення Ферменту на поверхні Неорганічних Адсорбентів: Оксидів та гідроксидів алюмінію, титану, цирконію, заліза; обпаленої кераміки, пористого скла, силікагелю та інших. Пізніше замість неорганічних використовувались природні та синтетичні органічні адсорбенти: клітковина, хітин, крохмаль та їх похідні; іонообмінні смоли — сефадекси і сефароза; гранульовані та волокнисті пластмаси — поліетилен, полістирол, поліуретан, нейлон, оксиалкілметакрилат та інші. Однак такі способи іммобілізації були малоефективними. Шар адсорбенту (насадка) швидко забруднювався продуктами реакції, активність ферменту знижувалась, частина ферменту змивалась з поверхні адсорбенту і втрачалася внаслідок слабкості зв’язку.
На зміну Адсорбційним Способам іммобілізації прийшли Хімічні. Для зміцнення зв’язку ферменту з носієм (основою) здійснювалось хімічне сполучення апофермента і основи за допомогою активних функціональних груп (аміно-, окси-, метокси-, карбокси – та сульфгідрильних тощо). Щоб запобігти ефекту екранування основою активного центру ферменту, використовувалось сполучення через подовжувачі (спейсери) — глутарову або адипінову кислоти та їх альдегіди.
Вельми ефективним виявився Спосіб іммобілізації ферМентів шляхом їх включення в структуру драглів і полімерів. При цьому способі розчин ферменту змішують з розчином драглеутворюючої речовини (альгінати, желатин, агар-агар, каррагінан та інші) і отриману суміш розбризкують у вигляді крапель в розчин задублювача (частіше за все розчин хлориду кальцію). Краплі суміші миттєво твердіють у вигляді гранул. Такий "гранульований" фермент дуже зручний у використанні н проточних реакторах, що дає змогу створити безперервний потоковий технологічний процес
Спосіб іммобілізації ферментів в структуру полімеру Полягає в тому, що в якості основи обирається високомолекулярна речовина з просторовою (трьохмірною) структурою. Перед її полімеризацією розчин мономіру змішують з ферментом, який під час полімеризації виявляється захопленим в його просторову сітку. Використовуючи цей спосіб можна виготовляти плівки, мембрани, трубки, блоки та інші конструктивні елементи, в структурі яких знаходиться фермент. Він доступний для молекул субстрату і надійно зафіксований, а тому багатократно бере участь в біохімічних процесах.
Близьким до цього є Спосіб іммобілізації шляхом утворення конгломератів З молекул ферменту або з суміші ферменту і Інертних білків чи інших високомолекулярних сполук. Конгломерати, тобто великі утворення з просторовою структурою, отримують методом "зшивання" апоферменту з носієм (інертним білком) за допомогою спеціальних речовин: гексаметилендиізоціанат, глутаровий альдегід, похідні триазину та інші.
Найбільш оригінальним способом іммобілізації є Спосіб інкапсилювання Ферменту, тобто включення його в капсулу, стінки якої є проникливими для субстрату. Для цього спочатку фермент "гранулюється" в структуру драглю, наприклад альгінатного, як було вказано вище. Потім гранули драглю з ферментом обробляються високомолекулярними сполуками, здатними утворювати напівпроникливі мембрани: полістиролом, поліуретаном, полікарбонатами, похідними клітковини, пектинів тощо. Після фіксації мембран гранули обробляють реагентами, які розчиняють і вимивають драглі (трилон Б, інші комплексони). Під їхньою дією драглі руйнуються, вимиваються, а фермент залишається усередині капсули ("фермент в клітці»).
Розглянуті та інші способи іммобілізації дозволяють вирішити одразу декілька складних технологічних проблем:
♦ багатократного використання дорогих препаратів ферментів;
♦ підвищення стійкості ферментів до впливу зовнішніх факторів;
♦ створення багатокомпонентних ферментних композицій для інтегральних технологій;
♦ створення умов для безперервного технологічного процесу;
♦ виключення забруднення кінцевої продукції ферментами;
♦ розширення сфери використання ферментів у харчових технологіях;
♦ підвищення економічної ефективності технологічних процесів.
Література:
1. П. П. Пивоваров, Д. Ю. Прасол. Теоретичні основи технології харчових виробництв. Х.: Харківський державний університет харчування та торгівлі, 2000. – 118 с.
2. Общая технология пищевых производств /Под ред. Ковалевской Л. П. – М.: Колос, 1993. -384с.
3. Общая технология пищевых производств /Под ред. Назарова Н. И. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. – 360 с.
4. Технология пищевых производств /Поду ред. Ковалевской Л. П. – М.: Колос, 1997.-707 с.
Реферати
Реферати :
Вам буде цікаво:
Ви прочитали: "Поняття іммобілізації ферментів та способи її проведення"Читати далі